分光光度計(jì)技術(shù)原理、構(gòu)造及應(yīng)用
分光光度計(jì)技術(shù)原理、構(gòu)造及應(yīng)用
分光光度計(jì)原理是我們從事實(shí)驗(yàn)室儀器研究和應(yīng)用的人員需要掌握的知識(shí)。分光光度計(jì)就是利用分光光度法對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定量定性分析的儀器。該儀器是實(shí)驗(yàn)室、科研機(jī)構(gòu)、醫(yī)療、農(nóng)業(yè)、食品廠、飲用水廠等機(jī)構(gòu)必備檢驗(yàn)設(shè)備。已經(jīng)成為現(xiàn)代分子生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)儀器。常用于核酸，蛋白定量以及細(xì)菌生長(zhǎng)濃度的定量。分光光度計(jì)基本原理是指采用一個(gè)可以產(chǎn)生多個(gè)波長(zhǎng)的光源，通過系列分光裝置，從而產(chǎn)生特定波長(zhǎng)的光源，光源透過測(cè)試的樣品后，部分光源被吸收，計(jì)算樣品的吸光值，從而轉(zhuǎn)化成樣品的濃度。樣品的吸光值與樣品的濃度成正比。單色光輻射穿過被測(cè)物質(zhì)溶液時(shí)，被該物質(zhì)吸收的量與該物質(zhì)的濃度和液層的厚度（光路長(zhǎng)度）成正比，其關(guān)系如下式：
A=-lg(I/I。)=-lgT=kLc
式中 ：
A 為吸光度；
I。為入射的單色光強(qiáng)度；
I 為透射的單色光強(qiáng)度；
T 為物質(zhì)的透射率；
k 為摩爾吸收系數(shù)；
L 為被分析物質(zhì)的光程，即比色皿的邊長(zhǎng)；
c 為物質(zhì)的濃度。
物質(zhì)對(duì)光的選擇性吸收波長(zhǎng)，以及相應(yīng)的吸收系數(shù)是該物質(zhì)的物理常數(shù)。當(dāng)已知某純物質(zhì)在一定條件下的吸收系數(shù)后可用同樣條件將該供試品配成溶液，測(cè)定其吸收度,即可由上式計(jì)算出供試品中該物質(zhì)的含量。在可見光區(qū)，除某些物質(zhì)對(duì)光有吸收外，很多物質(zhì)本身并沒有吸收但可在一定條件下加入顯色試劑或經(jīng)過處理使其顯色后再測(cè)定,故又稱比色分析。由于顯色時(shí)影響呈色深淺的因素較多，且常使用單色光純度較差的儀器，故測(cè)定時(shí)應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)品或?qū)φ掌吠瑫r(shí)操作。
核酸的定量
核酸的定量是分光光度計(jì)使用頻率最高的功能?？梢远咳苡诰彌_液的寡核苷酸，單鏈、雙鏈DNA，以及RNA。核酸的最高吸收峰的吸收波長(zhǎng)260nm。每種核酸的分子構(gòu)成不一，因此其換算系數(shù)不同。定量不同類型的核酸，事先要選擇對(duì)應(yīng)的系數(shù)。如：1OD的吸光值分別相當(dāng)于50μg/ml的dsDNA，37μg/ml的ssDNA，40μg/ml的RNA，30μg/ml的Olig。測(cè)試后的吸光值經(jīng)過上述系數(shù)的換算，從而得出相應(yīng)的樣品濃度。測(cè)試前，選擇正確的程序，輸入原液和稀釋液的體積，爾后測(cè)試空白液和樣品液。然而，實(shí)驗(yàn)并非一帆風(fēng)順。讀數(shù)不穩(wěn)定可能是實(shí)驗(yàn)者最頭痛的問題。靈敏度越高的儀器，表現(xiàn)出的吸光值漂移越大。
事實(shí)上，分光光度計(jì)的設(shè)計(jì)原理和工作原理，允許吸光值在一定范圍內(nèi)變化，即儀器有一定的準(zhǔn)確度和精確度。如Eppendorf Biophotometer的準(zhǔn)確度≤1.0%（1A）。這樣多次測(cè)試的結(jié)果在均值1.0%左右之間變動(dòng)，都是正常的。另外，還需考慮核酸本身物化性質(zhì)和溶解核酸的緩沖液的pH值，離子濃度等：在測(cè)試時(shí)，離子濃度太高，也會(huì)導(dǎo)致讀數(shù)漂移，因此建議使用pH值一定、離子濃度較低的緩沖液，如TE，可大大穩(wěn)定讀數(shù)。樣品的稀釋濃度同樣是不可忽視的因素：由于樣品中不可避免存在一些細(xì)小的顆粒，尤其是核酸樣品。這些小顆粒的存在干擾測(cè)試效果。為了最大程度減少顆粒對(duì)測(cè)試結(jié)果的影響，要求核酸吸光值至少大于0.1A，吸光值最好在0.1-1.5A。在此范圍內(nèi)，顆粒的干擾相對(duì)較小，結(jié)果穩(wěn)定。從而意味著樣品的濃度不能過低，或者過高（超過光度計(jì)的測(cè)試范圍）。最后是操作因素，如混合要充分，否則吸光值太低，甚至出現(xiàn)負(fù)值；混合液不能存在氣泡，空白液無(wú)懸浮物，否則讀數(shù)漂移劇烈；必須使用相同的比色杯測(cè)試空白液和樣品，否則濃度差異太大；換算系數(shù)和樣品濃度單位選擇一致；不能采用窗口磨損的比色杯；樣品的體積必須達(dá)到比色杯要求的最小體積等多個(gè)操作事項(xiàng)。
除了核酸濃度，分光光度計(jì)同時(shí)顯示幾個(gè)非常重要的比值表示樣品的純度，如A260/A280的比值，用于評(píng)估樣品的純度，因?yàn)榈鞍椎奈辗迨?80nm。純凈的樣品，比值大于1.8（DNA）或者2.0（RNA）。如果比值低于1.8或者2.0，表示存在蛋白質(zhì)或者酚類物質(zhì)的影響。A230表示樣品中存在一些污染物，如碳水化合物，多肽，苯酚等，較純凈的核酸A260/A230的比值大于2.0。A320檢測(cè)溶液的混濁度和其他干擾因子。純樣品，A320一般是0。
蛋白質(zhì)的直接定量（UV法）
分光光度計(jì)原理說明的這種方法是在280nm波長(zhǎng)，直接測(cè)試蛋白。選擇Warburg公式，光度計(jì)可以直接顯示出樣品的濃度，或者是選擇相應(yīng)的換算方法，將吸光值轉(zhuǎn)換為樣品濃度。蛋白質(zhì)測(cè)定過程非常簡(jiǎn)單，先測(cè)試空白液，然后直接測(cè)試蛋白質(zhì)。由于緩沖液中存在一些雜質(zhì)，一般要消除320nm的“背景”信息，設(shè)定此功能“開”。與測(cè)試核酸類似，要求A280的吸光值至少大于0.1A，最佳的線性范圍在1.0-1.5之間。實(shí)驗(yàn)中選擇Warburg公式顯示樣品濃度時(shí)，發(fā)現(xiàn)讀數(shù)“漂移”。這是一個(gè)正常的現(xiàn)象。事實(shí)上，只要觀察A280的吸光值的變化范圍不超過1%，表明結(jié)果非常穩(wěn)定。漂移的原因是因?yàn)閃arburg公式吸光值換算成濃度，乘以一定的系數(shù)，只要吸光值有少許改變，濃度就會(huì)被放大，從而顯得結(jié)果很不穩(wěn)定。蛋白質(zhì)直接定量方法，適合測(cè)試較純凈、成分相對(duì)單一的蛋白質(zhì)。紫外直接定量法相對(duì)于比色法來(lái)說，速度快，操作簡(jiǎn)單；但是容易受到平行物質(zhì)的干擾，如DNA的干擾；另外敏感度低，要求蛋白的濃度較高。
比色法蛋白質(zhì)定量
蛋白質(zhì)通常是多種蛋白質(zhì)的化合物，比色法測(cè)定的基礎(chǔ)是蛋白質(zhì)構(gòu)成成分：氨基酸（如酪氨酸，絲氨酸）與外加的顯色基團(tuán)或者染料反應(yīng)，產(chǎn)生有色物質(zhì)。有色物質(zhì)的濃度與蛋白質(zhì)反應(yīng)的氨基酸數(shù)目直接相關(guān)，從而反應(yīng)蛋白質(zhì)濃度。
比色方法一般有BCA，Bradford，Lowry 等幾種方法。
Lowry 法：以最早期的Biuret反應(yīng)為基礎(chǔ)，并有所改進(jìn)。蛋白質(zhì)與Cu2+反應(yīng)，產(chǎn)生藍(lán)色的反應(yīng)物。但是與Biuret 相比，Lowry法敏感性更高。缺點(diǎn)是需要順序加入幾種不同的反應(yīng)試劑；反應(yīng)需要的時(shí)間較長(zhǎng)；容易受到非蛋白物質(zhì)的影響；含EDTA，Tritonx-100，ammonia sulfate 等物質(zhì)的蛋白不適合此種方法。
BCA（Bicinchoninine acid assay）法：這是一種較新的、更敏感的蛋白測(cè)試法。要分析的蛋白在堿性溶液里與Cu2+反應(yīng)產(chǎn)生Cu+，后者與BCA形成螯合物，形成紫色化合物，吸收峰在562nm波長(zhǎng)。此化合物與蛋白濃度的線性關(guān)系極強(qiáng)，反應(yīng)后形成的化合物非常穩(wěn)定。相對(duì)于Lowry法，操作簡(jiǎn)單，敏感度高。但是與Lowry法相似的是容易受到蛋白質(zhì)之間以及去污劑的干擾。
Bradford法：這種方法的原理是蛋白質(zhì)與考馬斯亮蘭結(jié)合反應(yīng)，產(chǎn)生的有色化合物吸收峰595nm。其最大的特點(diǎn)是，敏感度好，是Lowry和BCA 兩種測(cè)試方法的2倍；操作更簡(jiǎn)單，速度更快；只需要一種反應(yīng)試劑；化合物可以穩(wěn)定１小時(shí)，方便結(jié)果；而且與一系列干擾Lowry，BCA反應(yīng)的還原劑（如DTT，巰基乙醇）相容。但是對(duì)于去污劑依然是敏感的。最主要的缺點(diǎn)是不同的標(biāo)準(zhǔn)品會(huì)導(dǎo)致同一樣品的結(jié)果差異較大，無(wú)可比性。
某些初次接觸比色法測(cè)定的研究者可能為各種比色法測(cè)出的結(jié)果并不一致，感到迷惑，究竟該相信哪種方法？由于各種方法反應(yīng)的基團(tuán)以及顯色基團(tuán)不一，所以同時(shí)使用幾種方法對(duì)同一樣品得出的樣品濃度無(wú)可比性。例如：Keller等測(cè)試人奶中的蛋白，結(jié)果Lowry，BCA測(cè)出的濃度明顯高于Bradford，差異顯著。即使是測(cè)定同一樣品，同一種比色法選擇的標(biāo)準(zhǔn)樣品不一致，測(cè)試后的濃度也不一致。如用Lowry測(cè)試細(xì)胞勻漿中的蛋白質(zhì)，以BSA作標(biāo)準(zhǔn)品，濃度1.34mg/ml，以a球蛋白作標(biāo)準(zhǔn)品，濃度2.64mg/ml。因此，在選擇比色法之前，最好是參照要測(cè)試的樣本的化學(xué)構(gòu)成，尋找化學(xué)構(gòu)成類似的標(biāo)準(zhǔn)蛋白作標(biāo)準(zhǔn)品。另外，比色法定量蛋白質(zhì)，經(jīng)常出現(xiàn)的問題是樣品的吸光值太低，導(dǎo)致測(cè)出的樣品濃度與實(shí)際的濃度差距較大。關(guān)鍵問題是，反應(yīng)后1011分光光度計(jì)的重要配件——比色杯的顏色是有一定的半衰期，所以每種比色法都列出了反應(yīng)測(cè)試時(shí)間，所有的樣品（包括標(biāo)準(zhǔn)樣品），都必須在此時(shí)間內(nèi)測(cè)試。時(shí)間過長(zhǎng)，得到的吸光值變小，換算的濃度值降低。除此，反應(yīng)溫度、溶液PH值等都是影響實(shí)驗(yàn)的重要原因。此外，非常重要的是，最好是用塑料的比色法。避免使用石英或者玻璃材質(zhì)的比色杯，因?yàn)榉磻?yīng)后的顏色會(huì)讓石英或者玻璃著色，導(dǎo)致樣品吸光值不準(zhǔn)確。
細(xì)菌細(xì)胞密度（OD 600）
實(shí)驗(yàn)室確定細(xì)菌生長(zhǎng)密度和生長(zhǎng)期，多根據(jù)經(jīng)驗(yàn)和目測(cè)推斷細(xì)菌的生長(zhǎng)密度。在遇到要求較高的實(shí)驗(yàn)，需要采用分光光度計(jì)準(zhǔn)確測(cè)定細(xì)菌細(xì)胞密度。OD600是追蹤液體培養(yǎng)物中微生物生長(zhǎng)的標(biāo)準(zhǔn)方法。以未加菌液的培養(yǎng)液作為空白液，之后定量培養(yǎng)后的含菌培養(yǎng)液。為了保證正確操作，必須針對(duì)每種微生物和每臺(tái)儀器用顯微鏡進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，做出校正曲線。實(shí)驗(yàn)中偶爾會(huì)出現(xiàn)菌液的OD值出現(xiàn)負(fù)值，原因是采用了顯色的培養(yǎng)基，即細(xì)菌培養(yǎng)一段時(shí)間后，與培養(yǎng)基反應(yīng)，發(fā)生變色反應(yīng)。另外，需要注意的是，測(cè)試的樣品不能離心，保持細(xì)菌懸浮狀態(tài)。
分光光度計(jì)的重要配件——比色杯
比色杯按照材質(zhì)大致分為石英杯、玻璃杯以及塑料杯。根據(jù)不同的測(cè)量體積，有比色杯和毛細(xì)比色杯等。一般測(cè)試核酸和紫外定量蛋白，均采用石英杯或者玻璃杯，但是不適合比色法測(cè)定。因?yàn)榉磻?yīng)中的染料（如考馬斯亮蘭）能讓石英和玻璃著色，所以必須采用一次性的塑料杯。而塑料杯一般不適合用于在紫外范圍內(nèi)測(cè)試樣品。
由于另外測(cè)試的樣品量不同，所以一般分光光度計(jì)廠家提供不同容積的比色杯以滿足用戶不同的需求。目前市場(chǎng)已經(jīng)存在一種既可用于核酸、紫外蛋白質(zhì)定量，亦可用于蛋白比色法測(cè)定的塑料杯，樣品用量?jī)H需50μl，比色杯單個(gè)無(wú)菌包裝，可以回收樣品。如EppendorfUVette®塑料比色杯，是目前比色杯市場(chǎng)上一個(gè)革新。隨著生命科學(xué)以及相關(guān)學(xué)科發(fā)展，對(duì)此類科學(xué)的實(shí)驗(yàn)研究提出更高的要求，分光光度計(jì)將是分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室不可缺少的儀器，也成為微生物、食品、制藥等相關(guān)實(shí)驗(yàn)室的必備設(shè)備之一。
分光光度原理
基本原理
利用紫外光、可見光、紅外光和激光等測(cè)定物質(zhì)的吸收光譜，利用此吸收光譜對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定性定量分析和物質(zhì)結(jié)構(gòu)分析的方法，稱為分光光度法或分光光度技術(shù)，使用的儀器稱為分光光度計(jì)，這種分光光度計(jì)靈敏度高，測(cè)定速度快，應(yīng)用范圍廣，其中的紫外/可見分光光度技術(shù)更是生物化學(xué)研究工作中必不可少的基本手段之一。
1. 光譜：
光是電磁波，可用波長(zhǎng)“λ”表示，電磁波譜是由不同性質(zhì)的連續(xù)波長(zhǎng)的光譜所組成，對(duì)于生物化學(xué)來(lái)說，最重要的波長(zhǎng)區(qū)域是可見光和紫外光。
光的波長(zhǎng)是二個(gè)相鄰的波峰之間的距離。
光的傳播是由相互垂直的電場(chǎng)分量“E”和磁場(chǎng)分量“H”所構(gòu)成。
λ＝C/ν
λ——波長(zhǎng) C——光速 ν——頻率，單位時(shí)間通過一個(gè)定點(diǎn)的波數(shù)。
光又可以看作是由具有能量的粒子所組成。這些粒子所具有的原能量“E”由下式算出：
E＝h•ν
H——普朗克常數(shù)（ 6.624×10-27爾格•秒）
ν——頻率
紫外區(qū)可分為紫外（近紫外）和真空紫外（遠(yuǎn)紫外）。由于吸收池（又稱樣品池、比色杯等）和光學(xué)元件以及氧氣能吸收小于190nm波長(zhǎng)的光，因此常規(guī)紫外測(cè)定集中在近紫外區(qū)，即200nm～400nm。可見光區(qū)為400nm～800nm。
組成物質(zhì)的分子均處于一定能態(tài)并不停地運(yùn)動(dòng)著，分子的運(yùn)動(dòng)可分為平動(dòng)、轉(zhuǎn)動(dòng)、振動(dòng)和分子內(nèi)電子的運(yùn)動(dòng)，每種運(yùn)動(dòng)狀態(tài)都處于一定的能級(jí)，因此分子的能量可以寫成：
E＝E0+E平+E轉(zhuǎn)+E振+E電
E0是分子內(nèi)在的不隨分子運(yùn)動(dòng)而改變的能量，平動(dòng)能E平只是溫度的函數(shù)，因此與光譜有關(guān)的能量變化是分子的轉(zhuǎn)動(dòng)能量、振動(dòng)能量和分子的電子能量。
分子的每一種能量都有一系列的能級(jí)，能級(jí)不是任意的，而是具有量子化特征的，通常分子處于基態(tài)，當(dāng)它吸收一定能量躍遷到激發(fā)態(tài)，則產(chǎn)生吸收光譜。分子轉(zhuǎn)動(dòng)、振動(dòng)和電子能級(jí)的躍遷，相應(yīng)地產(chǎn)生轉(zhuǎn)動(dòng)、振動(dòng)及電子光譜。
按照量子力學(xué)原理，分子能態(tài)按一定的規(guī)律跳躍式地變化，物質(zhì)在入射光的照射下，分子吸收光時(shí)，其能量的增加是不連續(xù)的，物質(zhì)只能吸收一定能量的光，吸收光的頻率和兩個(gè)能級(jí)間的能量差要符合下列關(guān)系：
E＝E2- E1＝h
E1、E2分別表示初能態(tài)和終能態(tài)的能量，初能態(tài)與終能態(tài)之間的能量差愈大，則所吸收的光的頻率愈高（即波長(zhǎng)愈短），反之則所吸收的光的頻率愈低（即波長(zhǎng)愈長(zhǎng)）。由于吸收是不連續(xù)的，因此在光的一定部位出現(xiàn)一系列吸收暗帶。因?yàn)榉肿愚D(zhuǎn)動(dòng)、振動(dòng)及電子能級(jí)躍遷的能量差別較大，因此，它們的吸收光譜出現(xiàn)在不同的光譜區(qū)域。分子轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)級(jí)差小，△E＜0.05電子伏特（ev），分子轉(zhuǎn)動(dòng)光譜的吸收出現(xiàn)在遠(yuǎn)紅外或微波區(qū)。振動(dòng)能級(jí)縱間的差別較大，E＝0.05～1.0 ev，振動(dòng)光譜出現(xiàn)在中紅外區(qū)。電子能級(jí)的級(jí)差更大， E＝1～20ev，所以由電子躍遷得到的光譜出現(xiàn)在可見、紫外或波長(zhǎng)更短的光譜區(qū)。
分光光度計(jì)原理說明，可見光、紫外光吸收光譜，是由于分子中聯(lián)系較松散的價(jià)電子被激發(fā)產(chǎn)生躍遷從而吸收光輻射能量形成的，即分子由基態(tài)變?yōu)榧ぐl(fā)態(tài)，電子由一個(gè)低能級(jí)的軌道（即成鍵軌道），吸收了光能量躍遷到高能級(jí)軌道（稱為反鍵軌道）。
與吸收光譜有關(guān)的三種電子是：
⑴ 二個(gè)原子的電子沿其對(duì)稱方向相互形成的共價(jià)鍵（即單鍵），稱σ 鍵， 構(gòu)成 鍵的電子稱σ電子，如C－C、C－H鍵。
⑵ 平行于二個(gè)原子軌道形成的價(jià)鍵（即雙鍵），稱π 鍵，形成π鍵的電子稱為 π電子，如C=C鍵。
⑶ 未共享成鍵的電子，稱n電子。
各種電子躍遷所需能量大小的順序是：
n→π*＜π→π*≤ n→σ*＜π→σ*＜σ→π*＜σ→σ*
紫外吸收光譜主要是由于雙鍵電子，尤其是共軛雙鍵中的π電子和未共享的電子對(duì)的激發(fā)所產(chǎn)生的。所以各種物質(zhì)分子對(duì)紫外光的吸光性質(zhì)取決于該分子的雙鍵數(shù)目和未共享電子對(duì)的共軛情況等。
如下表所示：
電子躍遷類型與紫外吸收波長(zhǎng)(nm)關(guān)系表
電子躍遷類型 例 子 紫外吸收波長(zhǎng)范圍
σ→σ* C－H 100～150 nm
π→π*( 非共軛 ) C＝O ＜200 nm
π→π*( 共軛 ) ＝C－C＝ 200～300 nm
n→π* C＝O ～300 nm
π→π*躍遷：此類躍遷所需能量較小，吸收波長(zhǎng)在紫外區(qū)的200～300
nm，不飽和烴、共軛烯烴及芳香烴均可發(fā)生這類躍遷，氨基酸、蛋白質(zhì)與核酸均含有大量共軛雙鍵，因而200～300
nm的紫外吸收測(cè)定，在生化實(shí)驗(yàn)技術(shù)中有極廣泛的用途。
若逐漸改變照射某物質(zhì)的入射光的波長(zhǎng)，并測(cè)定物質(zhì)對(duì)各種波長(zhǎng)光的吸收程度（吸光度“A”或光密度“O.D”）或透射程度（透光度“T”），以波長(zhǎng)λ作橫坐標(biāo)，“A”或“T”為縱座標(biāo)，畫出連續(xù)的“A~λ”或“T~λ”曲線，即為該物質(zhì)的吸收光譜曲線。
吸光度 A
D
C
B
λmax λmin 波長(zhǎng)(nm)
由上圖可以看出吸收光譜的特征：
⑴曲線上“A”處稱最大吸收峰，它所對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)稱最大吸收波長(zhǎng)，以λmax表示。
⑵曲線上“B”處有一谷，稱最小吸收，它所對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)，所對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)，稱最小吸收波長(zhǎng)，以λmin 表示。
⑶曲線上在最大吸收峰旁邊有一小峰“C”，稱肩峰。
⑷在吸收曲線的波長(zhǎng)最短的一端，曲線上“D”處，吸收相當(dāng)強(qiáng)，但不成峰形，此處稱為末端吸收。
λmax是化合物中電子能級(jí)躍遷時(shí)吸收的特征波長(zhǎng)，不同物質(zhì)有不同的最大吸收峰，所以它對(duì)鑒定化合物極為重要。吸收光譜中，λmax、λmin、肩峰以及整個(gè)吸收光譜的形狀決定于物質(zhì)的性質(zhì)，其特征隨物質(zhì)的結(jié)構(gòu)而異，所以是物質(zhì)定性的依據(jù)。
測(cè)定某物質(zhì)的紫外吸收光譜的曲線，可與已知標(biāo)準(zhǔn)的紫外光譜圖相對(duì)照，對(duì)照時(shí)須注意測(cè)定的條件，如溶劑、濃度等。
常用標(biāo)準(zhǔn)的紫處吸收光譜是薩德勒研究實(shí)驗(yàn)公司編制的“Sadtler”紫外標(biāo)準(zhǔn)圖譜集，到七十年代末為止已收集28585個(gè)化合物紫外光譜圖，此外還有藥物和非極性溶劑紫外光譜圖2000多幅。
由于化合物紫外吸收峰較少，而且峰形都很寬，不象紅外光譜是許多指紋峰，所以在用紫外吸收光譜進(jìn)行化合物定性鑒定時(shí)，應(yīng)注意：化合物相同，其紫外光譜應(yīng)完全相同；但是紫外光譜相同不一定化合物就相同，可能僅是存在某些相同的發(fā)色團(tuán)或基團(tuán)，因此在鑒定時(shí)應(yīng)與紅外光譜相結(jié)合。
由于電子躍遷的同時(shí)也引起分子的轉(zhuǎn)動(dòng)和振動(dòng)光譜，要把電子躍遷和分子振動(dòng)、轉(zhuǎn)動(dòng)的躍遷完全分開是不可能的，因此我們常見的紫外吸收光譜是由一個(gè)或幾個(gè)寬的吸收譜帶所組成。
紫外光譜中常用的術(shù)語(yǔ)有發(fā)色團(tuán)、助色團(tuán)、增色效應(yīng)和減色效應(yīng)。
發(fā)色團(tuán)：凡是與飽和碳?xì)浠衔镞B接能引起n→π*、π→π*、 n→σ*
等電子躍遷的基團(tuán)稱為發(fā)色團(tuán)。例如：C＝C、C＝O等發(fā)色團(tuán)。
助色團(tuán)：助色團(tuán)是一些具有非共價(jià)鍵的基團(tuán)（如OH、NH2、SH等）。這些基團(tuán)在波長(zhǎng)＞200nm處沒有吸收，當(dāng)它與發(fā)色團(tuán)相連接時(shí)，使發(fā)色團(tuán)的吸收帶向長(zhǎng)波移動(dòng)，稱為紅移（或淺色效應(yīng)），紅移的同時(shí)吸收帶的強(qiáng)度增加。若助色團(tuán)與發(fā)色團(tuán)相連接，產(chǎn)生n→π* 躍遷，使吸收波長(zhǎng)向短波移動(dòng)，稱為蘭移（或深色效應(yīng)）。
增色效應(yīng)（hyperchromic effect）:
核酸變性或降解，使得DNA或RNA溶液對(duì)紫外光的吸收明顯增加，即ε值（吸光系數(shù)或稱消光系數(shù)）顯著升高，此現(xiàn)象稱為增色效應(yīng)。此效應(yīng)是由于堿基之間電子相互作用的改變所致，通常在260nm處測(cè)量。
減色效應(yīng)（hypochromic effect）:
在一定的條件下，變性的核酸又可以復(fù)性，此時(shí)ε值又明顯減少，回復(fù)到原來(lái)的核酸分子ε值較低的水平，即此時(shí)DNA或RNA溶液的紫外光吸收顯著降低，此現(xiàn)象稱為減色效應(yīng)，此效應(yīng)也是由于堿基之間電子相互作用的變化所引起的，通常在260nm條件下測(cè)量。
2. 光吸收定律：
朗伯——比爾（Lambert－beer）光吸收定律：
A＝－lgT＝εb c
A——吸光度，又稱光密度“O.D”。
T——透光度， T＝I / I。， I。——為照射到吸收池上的光強(qiáng)，I——為透過吸收池的光強(qiáng)。
ε——摩爾吸光系數(shù)或克分子吸光系數(shù)（L•mol－1•cm－1）。
b——樣品光程（cm），通常使用1.0cm 的吸收地，b=1cm。
C——樣品濃度（mol/L）。
由上式可以看出：吸光度A與物質(zhì)的吸光系數(shù)“ε”和物質(zhì)的濃度“C”成正比。
摩爾吸光系數(shù)：是物質(zhì)對(duì)某波長(zhǎng)的光的吸收能力的量度。ε越大，吸收光的能力越強(qiáng)，相應(yīng)的分光度法測(cè)定的靈敏度就越高。ε值越大，說明電子躍遷的幾率大，通常ε＝10～105：一般認(rèn)為ε＞ 104為強(qiáng)吸收；ε＝103～104 為較強(qiáng)吸收；ε＜ 102為弱吸收，此時(shí)分光光度法不靈敏。因?yàn)橥ǔＪ褂梅止夤舛扔?jì)可檢測(cè)出的最小吸光度A＝0.001, 所以，當(dāng)b＝1cm,ε＝105時(shí)，可檢測(cè)的溶液最小濃度是C＝10-8 mol/L。
常用的吸光系數(shù)還有一種百分吸光系數(shù)，即在某一波長(zhǎng)下，溶液濃度為1%（W /V），液層厚度b＝1cm時(shí)的吸光度，以E1%λmax表示。
C——百分濃度（W / V）。
L——液層厚度，吸收杯光徑長(zhǎng)度。 A——吸光度。
最大吸收波長(zhǎng)λmax時(shí)的ε 和E1%λmax值可用下式換算：
ε＝E1%λmax×分子量 / 10
吸光度“A”有一個(gè)重要性質(zhì)是其具有加和性：
A＝ε1C1b1＋ε2C2b2＋ε3C3b3＋……＝
即混合物的總吸光度等于溶液中的各組份各自在該波長(zhǎng)下吸光度的算術(shù)和。這是多元混合物分光光度法定量分析的基礎(chǔ)。
若溶液中各溶質(zhì)的吸光系數(shù)ε相同，則各溶質(zhì)吸光度的大小與溶質(zhì)濃度成比例。例如，離子交換柱層析分離核苷酸實(shí)驗(yàn)中可利用吸光度計(jì)算回收率：
m＝C•V ， ∵ ， ∴
m——溶質(zhì)的量 C——溶質(zhì)濃度
V——溶液體積 A——吸光度
ε——吸光系數(shù) b——吸收池光徑
∴ 回收率 （100%）
（上式中假設(shè)ε總和各核苷酸的ε近似相等）
例一：尿嘧啶核苷酸溶液用1cm石英吸收池測(cè)定
260nm處的吸光度為0.650，用同一吸收池測(cè)定純?nèi)軇┑奈舛葹?.070，計(jì)算尿嘧啶溶液的摩爾濃度，已知其摩爾吸光系數(shù)
= 8.2×103 M－1cm－1（M＝mol / L）。
A＝ εbC ∵ A＝（溶劑加樣品的吸光度）－（溶劑的吸光度）
A＝0.650－0.070＝0.580 ∵ b＝1cm
C==7.1×10－5 mol / L
例二：1%（W/V，10 mg /
ml）酪氨酸酶溶液的吸光度為24.9（1cm吸收池，280nm），計(jì)算A280=0.250的酪氨酸酶溶液的濃度。
由于這兩種酶溶液的百分吸光系數(shù)“E1%1cm，280nm”是相同的，因此可用正比例法計(jì)算濃度。
C未知＝0.01％＝0.1mg / ml
分光光度計(jì)的組成和構(gòu)造
1.組成：各種型號(hào)的紫外/可見分光度計(jì)，不論是何種型式，基本上都由五部分組成：（1）光源；（2）單色器（包括產(chǎn)生平行光和把光引向檢測(cè)器的光學(xué)系統(tǒng)）；（3）樣品室；（4）接收檢測(cè)放大系統(tǒng)；（5）顯示或記錄器。
國(guó)產(chǎn)分光光度計(jì)近年來(lái)已有很大的發(fā)展，各種檔次的分光光度計(jì)都已更新升級(jí)換代，可見光系列有：721、722、723等型號(hào)，紫外/可見光系列有：751、752、753、754、756等型號(hào)，主要生產(chǎn)廠為上海譜元儀器等。
瑞士KONTRON康強(qiáng)公司生產(chǎn)的UNICON860型紫/可見光分光光度計(jì)，是雙光束、快速自動(dòng)掃描、熒屏顯示的高檔分光光度計(jì)。這種雙光束分光光度計(jì)的特點(diǎn)是來(lái)自光源的連續(xù)光譜經(jīng)凹面全息光柵分光后，由出射狹縫得到單色光，經(jīng)過由電機(jī)帶動(dòng)的25周/秒左右的旋轉(zhuǎn)鏡分解為“樣品”、“參比”光束，順序分時(shí)通過參比池和樣品吸收池，照射到光電倍增管上，由于兩條光路是幾乎同時(shí)測(cè)量，參比信號(hào)又不斷與標(biāo)準(zhǔn)電壓比較，使參比信號(hào)恒定，所以由光源、單色器、外界雜光、光電倍增管以及電源電壓等帶來(lái)的影響，儀器均能自動(dòng)消除。最快波長(zhǎng)掃描速度為1200nm/min，有五種測(cè)量功能和五種數(shù)據(jù)處理功能。
200分光光度計(jì)的樣品和參比光路，分別有各自的帶溫控的光電二極管檢測(cè)器，因而取消了電機(jī)帶動(dòng)的旋轉(zhuǎn)鏡，大大提高了儀器的穩(wěn)定性及各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)，其波長(zhǎng)范圍是190nm～1100nm，吸光度測(cè)定范圍是0～3A，可變狹縫寬度為1nm、2nm和5nm，儀器使用微機(jī)控制時(shí)，掃描速度最高可達(dá)6000nm/min，寬大的樣品室可以安裝各種附件，儀器性能優(yōu)良，適合教學(xué)、科研使用。該儀器的使用說明詳見附錄。
2. 構(gòu)造：
⑴ 光源：
理想光源的條件是：①能提供連續(xù)的輻射；②光強(qiáng)度足夠大；③在整個(gè)光譜區(qū)內(nèi)光譜強(qiáng)度不隨波長(zhǎng)有明顯變化；④光譜范圍寬；⑤使用壽命長(zhǎng)，價(jià)格低。
用于可見光和近紅外光區(qū)的光源是鎢燈，現(xiàn)在最常用的是鹵鎢燈（Halogenlamp），即石英鎢燈泡中充以鹵素，以提高鎢燈的壽命。適用波長(zhǎng)范圍是320～1100nm。由于能量輸出的波動(dòng)為電壓波動(dòng)的四次方倍，因此電源電壓必須穩(wěn)定。
用于紫外光區(qū)的是氘燈（Deuteriumlamp），適用波長(zhǎng)范圍是195～400nm，由于氘燈壽命有限，國(guó)產(chǎn)氘燈壽命僅五百小時(shí)左右，要注意節(jié)約燈時(shí)。
⑵ 單色器：
單色器是分光光度計(jì)的心臟部分，它的作用是把來(lái)自光源的混合光分解為單色光并能隨意改變波長(zhǎng)。它的主要組成部件和作用是：
①入射狹縫——限制雜散光進(jìn)入。
②色散元件——即棱鏡或光柵，是核心部件，可將混合光分解為單色光。
③準(zhǔn)直鏡——把來(lái)自入射狹縫的光束轉(zhuǎn)化為平等光，并把來(lái)自色散元件的平等光聚焦于出射狹縫上。
④出射狹縫——只讓額定波長(zhǎng)的光射出單色器。
轉(zhuǎn)動(dòng)棱鏡或光柵的波長(zhǎng)盤，可以改變單色器出射光束的波長(zhǎng)；調(diào)節(jié)出入射狹縫隙的寬度，可以改變出射光束的帶寬和單色光的純度。
光柵：光柵有透射光柵和反射光柵，實(shí)際應(yīng)用的都是反射光柵，它又可分為平面反射光柵（即通稱的反射光柵或閃爍光柵）和凹面反射光柵兩類，凹面反射光柵可以起色散元件和準(zhǔn)直鏡兩個(gè)作用，使色散后的光束聚焦于出射狹縫，得到銳線光譜。
光柵的刻制方法有兩種：
機(jī)刻光柵：用金剛刀擠壓鍍于硬質(zhì)玻璃上0.5~1的鋁反射層而得。刻制工作量極大，一般每分鐘只能刻10條線，刻100mm寬的600線/mm的光柵要100小時(shí)。最多刻到3600線/mm。由于其制造周期長(zhǎng)，成本高，一般只能制得少量的母光柵，而實(shí)際應(yīng)用的多是復(fù)制光柵，即在母光柵上涂上硅油，再鍍上一層鋁，用環(huán)氧樹脂粘下來(lái)，就得到復(fù)制光柵。機(jī)刻光柵的缺點(diǎn)是線槽稍有缺陷時(shí)就會(huì)出現(xiàn)“鬼線”，即位于光譜強(qiáng)線兩側(cè)的模糊不清的假線。
全息光柵：用全息照相法刻制的高精度光柵。即用高強(qiáng)度的相干性極好的單色光，如激光，用高分辨的感光材料——光致抗蝕劑記錄干涉條紋，曝光1小時(shí)，化學(xué)處理掉受光部分，再進(jìn)行真空鍍膜（鍍鋁），得到全息反射光柵。這種光柵幾乎沒有線槽間的周期誤差，幾乎沒有“鬼線”，雜散光很少。最大線槽密度可達(dá)6500線/mm，最大直徑可達(dá)400mm，刻線越多，分辨率就越高，最常用的是1200~1500線/mm的全息光柵。
狹縫、光譜頻帶寬度和分辨率：
出射狹縫的寬度通常有兩種表示方法：一為狹縫的實(shí)際寬度，以毫米（mm）表示，另一種為光譜頻帶寬度，即指由出射狹縫射出光束的光譜寬度，以毫微米nm表示。例如，出射狹縫的寬度是6nm，并不是說出射狹縫的寬度是6nm，而是指由此狹縫射出的光具有6nm的光譜帶寬。
純粹的單色光只是一種理想情況，分光光度計(jì)所能得到的“單色光”，實(shí)際上只是具有一定波長(zhǎng)范圍的譜帶，狹縫越寬，所包括的波長(zhǎng)范圍也愈寬。
對(duì)單色光純度來(lái)說，狹縫是愈窄愈好，但光的強(qiáng)度也就越弱，因此狹縫不能無(wú)限制地小，狹縫的最小寬度取決于檢測(cè)器能準(zhǔn)確地進(jìn)行測(cè)量的最小光能量。目前達(dá)到的最小寬度為0.1nm。
光譜有效頻帶寬度“b’”——是檢測(cè)器檢測(cè)到的光能量為峰值一半處的二點(diǎn)間的波長(zhǎng)間隔，如下所示：
光強(qiáng)度 P
b’ ——光譜有效頻帶寬（nm）
b ——狹縫寬度（mm） 1/2h
——線色散率 b’ 光譜有效頻帶寬b’
dλ——波長(zhǎng)差 1/2h
dS——出射狹縫平面上二條 波長(zhǎng)λ
光線（dλ）所分開的距離（mm）
由上式可以看出，b’與b成正比， 與線色散率成反比。線色散率越大，則可得到的有效頻帶寬度越小。
分辨率：是儀器對(duì)相鄰的兩個(gè)峰可分辨的最小波長(zhǎng)間隔，是儀器分辨鄰近二條譜線的能力。
例如若可分開鈉雙線：則高的分辨率可達(dá)：R=105。所以，狹縫寬度b越小，光譜帶寬b’越小，分辨率就越高。
何種情況算是能夠分辨：定義為二條譜線的峰與谷處于同一位置時(shí)，此二個(gè)峰認(rèn)為是剛好能分辨。
由于光柵分光其色散是線性的，所以只用一種狹縫寬度對(duì)各種波長(zhǎng)的光的測(cè)量，其分辨率都相同，即狹縫寬度不必經(jīng)常調(diào)節(jié)。只要光強(qiáng)能達(dá)到要求，應(yīng)使用盡可能小的狹縫寬度，以提高分辨率。
⑶樣品室：包括有池架、吸收池（即比色杯）、以及各種可更換的附件。池架有普通池架和恒溫池架，恒溫池架有水恒溫池架和電恒溫池架。水恒溫池架需用循環(huán)水恒溫裝置打入循環(huán)水保持池架恒溫，控溫精度為0.1℃，電恒溫池架十分昂貴，控溫精度可達(dá) 0.05℃。
吸收池有光學(xué)玻璃杯和石英玻璃杯兩種。光學(xué)玻璃杯因?yàn)槠胀ü鈱W(xué)玻璃吸收紫外光，因此只能用于可見光，適用波長(zhǎng)范圍是400nm～2000nm。石英玻璃杯可透過紫外光、可見光和紅外光，是最常使用的吸收池，使用波長(zhǎng)范圍是180nm～3000nm。
吸收池的形狀有長(zhǎng)方形，方形和園筒形，光程可由0.1cm至10cm，最常用的是1cm池（容積3ml），光程要求極精確，透光的玻璃面要嚴(yán)格垂直于光路，有的石英杯上方刻有箭頭“→”，標(biāo)明杯子使用時(shí)的透光方向，反方向使用會(huì)有偏差。
有各種用途的石英吸收池：如液體池、氣體池、微量池（容積5μl～1ml）、流動(dòng)池（測(cè)量連續(xù)流動(dòng)的樣品）、長(zhǎng)光徑池（測(cè)量稀溶液用）、可裝拆池（便于清洗）等。石英杯通常還配有玻璃或塑料蓋，用以防止樣品揮發(fā)和氧化，以及杯內(nèi)樣品的快速混合。
吸收池使用注意事項(xiàng)：
① 要徹底清洗，尤其是盛過蛋白質(zhì)等溶液，干后形成一層膜，不易洗去，通常杯子不用時(shí)可放在
1％洗潔凈液中浸泡，去污效果好，使用時(shí)用水沖洗干凈，要求杯壁不掛水珠，還可以用綢布絲線或軟塑料制作一個(gè)小刷子清洗杯子。
② 嚴(yán)禁用手指觸摸透光面，因指紋不易洗凈。嚴(yán)禁用硬紙和布擦拭透光面，只能使用鏡頭紙和綢布。
③ 嚴(yán)禁加熱烘烤。急用干的杯子時(shí)，可用酒精蕩洗后用冷風(fēng)吹干。決不可用超聲波清洗器清洗。
④吸收池的校正：要固定參比杯和樣品杯，可在杯的毛玻璃面上寫上記號(hào)。用盛有參比液的參比杯和樣品杯測(cè)定吸光度“A0”，樣品杯換上樣品液后測(cè)定的吸光度為“A1”，則校正后的實(shí)際吸光度A為：A= A1－A0高檔的分光光度計(jì)有自動(dòng)置零系統(tǒng)，可將二個(gè)杯子的偏差置零。
其他重要附件：
高檔分光光度計(jì)的樣品室還可以更換各種重要附件，用于各種特殊量測(cè)。如換上“積分球”，可用來(lái)檢測(cè)微弱透光和不透光的樣品。換上“凝膠掃描裝置”，可用于電泳凝膠膠條上樣品帶的掃描測(cè)量。
⑷ 檢測(cè)器：檢測(cè)器是一種光電轉(zhuǎn)換設(shè)備，即把光強(qiáng)度以電訊號(hào)顯示出來(lái)，常用的檢測(cè)器有光電管，光電倍增管和光電二極管等三種。
①光電管：光電管可檢測(cè)10微微安（10-11A）的光電流，管內(nèi)抽真空充入惰性氣體，常用國(guó)產(chǎn)真空光電管有GD-5蘭敏光電管（適用波長(zhǎng)為210～625nm）；GD-6紅敏光電管（適用波長(zhǎng)為625～1000nm）。751型分光光度計(jì)即使用這兩只光電管。
②光電倍增管：它是檢測(cè)弱光的最靈敏最常用的光電元件，其靈敏度比光電管高200多倍，光電子由陰極到陽(yáng)極重復(fù)發(fā)射9次以上，每一個(gè)光電子最后可產(chǎn)生106～107個(gè)電子，因此總放大倍數(shù)可達(dá)106～107倍，光電倍增管的響應(yīng)時(shí)間極短，能檢測(cè)10-8～10-9秒級(jí)的脈沖光。其靈敏度與光電管一樣受到暗電流的限制，暗電流主要來(lái)自陰極發(fā)射的熱電子和電極間的漏電。
③光電二極管：其原理是這種硅二極管受紫外～近紅外輻射照射時(shí)，其導(dǎo)電性增強(qiáng)的大小與光強(qiáng)或正比。近年來(lái)分光光度計(jì)使用光電二極管作檢測(cè)器在增加，雖然其靈敏度還趕不上光電倍增管，但它的穩(wěn)定性更好，使用壽命更長(zhǎng)，價(jià)格便宜，因而許多著名品牌的高檔分光光度計(jì)都在使用它作檢測(cè)器。尤其值得注意的是由于計(jì)算機(jī)技術(shù)的飛速發(fā)展，使用光電二極管的二極管陣列分光光度計(jì)有了很大的發(fā)展，二極管數(shù)目已達(dá)1024個(gè)，大大提高了分辨率。這種新型分光光度計(jì)的特點(diǎn)是“后分光”，即氘燈發(fā)射的光經(jīng)透鏡聚焦后穿過樣品吸收池，經(jīng)全息光柵色散后被二極管陣列的各個(gè)二極管接收，信號(hào)由計(jì)算機(jī)進(jìn)行處理和存儲(chǔ)，因而掃描速度極快，約10ms就可完成全波段掃描，繪出吸光度、波長(zhǎng)和時(shí)間的三維立體色譜圖，可以最方便快速地得到任一波長(zhǎng)的吸收數(shù)據(jù)，它最適宜用于動(dòng)力學(xué)測(cè)定，也是高效液相色譜儀最理想的檢測(cè)器。
⑸ 顯示裝置：低檔分光光度計(jì)現(xiàn)在已都使用數(shù)字顯示，有的還連有打印機(jī)。現(xiàn)代高性能分光光度計(jì)均可以連接微機(jī)，而且有的主機(jī)還使用帶液晶或CRT熒屏顯示的微處理機(jī)和打印繪圖機(jī)，有的還帶有標(biāo)準(zhǔn)軟驅(qū)，存取數(shù)據(jù)更加方便（例如SPECORD200）。
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